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        微量凱氏定氮法測定蛋白質總含量

        發布時間:2016-07-07 點擊次數:3073

        微量凱氏定氮法測定蛋白質總含量

        一、實驗原理

         天然有機物(如蛋白質和氨基酸等化合物)的總氮量通常用微量凱氏定氮法(micro-kjeldahl method)來測定。

        當被測的天然含氮化合物與濃硫酸共熱時分解出氨,氨與硫酸反應生成硫酸銨,此過程稱為消化。由于消化過程進行緩慢,實驗中常添加硫酸鉀和硫酸銅的混合物來促進,硫酸銅是催化劑,硫酸鉀可提高消化液的沸點。氧化劑過氧化氫也能加速反應。消化完成后,在凱氏定氮儀中加入強堿堿化消化液,使碳酸銨分解出氨。用水蒸汽蒸餾法將氨蒸入無機酸溶液中,然后再用標準酸溶液進行滴定。

         上述過程的化學反應如下:

                在微量凱氏定氮法中,常用硼酸-指示劑混合液收集氨,氨與溶液中氫離子結合生成銨離子,使溶液中氫離子濃度降低,指示劑顏色發生改變,然后用標準無機酸滴定,直至恢復溶液中原來氫離子濃度,即指示劑變回原來顏色為止。所用無機酸的摩爾數即相當于樣品中氨的摩爾數,本法適用范圍約為0.2~1mg氨。

               因為蛋白質含氮量通常在16%左右,所以將凱氏定氮法測得的含氮量乘上系數6.25,便得到該樣品的蛋白質含量。

         

        二、實驗用品

        (一)器材

         (1)微量凱氏定氮儀。

         (2)50ml凱氏燒瓶,100ml錐型瓶,50ml酸式滴定管,100ml量筒,100ml容量瓶,

              100ml燒杯,酒精燈。

        (二)試劑

           (1)無水Diethyl Ether(AR)

           (2)粉末硫酸鉀-硫酸銅混合物:K2SO4:CuSO4.5H2O=3:1、6:1或10:1。

           (3)40%(W/V)NaOH溶液。

           (4)4%(W/V)硼酸溶液。

           (5)0.01mol/L標準鹽酸(用硼砂標定):吸取分析純HCL(比重1.19,約12mol/L)8.5ml,用蒸餾水稀釋至1L,貯于試劑瓶中待標定。準確稱取3份干燥的硼砂,每份0.381~0.383g分別放在150ml三角瓶中,加入20ml蒸餾水使其溶解,加入3滴甲基紅指示劑(0.1g甲基紅溶于250ml水中),用待測的鹽酸滴定至橙紅色為止,記下鹽酸的滴定體積,通過計算即可知道鹽酸的準確濃度:

         

         

        (三)、材料

             豆漿(市售)。

         

        • 實驗程序

          (一)操作方法

           1.樣品的消化

             在凱氏燒瓶中加入催化劑約50mg,用移液管依次加入3mL均一的豆漿和3ml濃硫酸(移液管要接近凱氏燒瓶底部,不使樣品粘附在瓶口或瓶頸)。另取一支凱氏燒瓶加入3ml水代替豆漿,其余試劑同上,此為空白。

           將凱氏燒瓶放在通風柜內的電爐上加熱,火力不要太猛,應以使液體保持微沸狀態為宜。瓶內液體逐漸由黃色變為黑色,繼而轉為淡黃色,zui后成清澈藍色溶液,消化即告完全,取出燒瓶,冷卻,將瓶內液體轉移至50ml容量瓶中,加蒸餾水定容至刻度。

         2.儀器的裝置和蒸洗

           按圖9-1裝好凱氏定氮儀,再用蒸氣進行蒸洗,以除去NH和其他干擾物質。蒸洗方法如下:          

          接通冷凝水,打開夾子(J) ,往蒸餾瓶(B)內加入占球部1/3體積的清水,而后取5ml蒸餾水從小漏斗(A)緩慢地注入反應瓶(F),關上夾子(I),同時加熱蒸餾瓶(B),蒸餾反應瓶內的蒸餾水,使其沸騰產生蒸汽。產生的氣體沿導管上升到冷凝管(C),氣體經過冷卻從冷凝管末端(G)流入收集瓶。排出反應瓶(F)中的液休,重復蒸洗2~3次,以便較熟練掌握蒸洗的方法。反應瓶(F)中的液體排出的方法:樣品蒸餾完畢后,繼續加熱使其沸騰,移開酒精燈,關上夾子(I),稍等片刻,由于蒸餾瓶(B)中的蒸汽較反應瓶(F)中的多,所以冷卻后蒸餾瓶(B)中的壓力比反應瓶(F)的低,反應瓶(F)內的廢液迅速地從出樣口(H)抽出到反應瓶外,隨即自加樣小漏斗(A)往反應瓶(F)中較快地倒入一子(K)排出蒸餾瓶中的熱水,關上夾子(I),稍等片刻,反應瓶(F)內的液體又迅速地從出樣口(H)抽出,然后打開夾子(K)排出蒸餾瓶中的熱水,關上夾子(K),打開夾子(J),往蒸餾瓶(B)中加入1/3球部體積的清水,即可進行下一次蒸餾。儀器的安裝和蒸洗過程中,應很好地掌握幾個夾子的開關關系,避免漏氣是實驗成敗的關鍵。

        3.標準硫酸銨的測定

          (1) 吸取10 mL 4%硼酸溶液注入三角燒瓶,加人2滴指示劑,將其傾斜地放在冷凝管末端(G)下,使管末端插人溶液內。

         (2) 用移液管準確吸取5ml標準硫酸銨溶液置于小漏斗(A),小心打開夾子(I),使其緩慢注入反應瓶(H),用1?2 mL蒸餾水沖洗漏斗后放入反應瓶(H)。

         (3) 量取5 ml 40% NaOH溶液,置小漏斗(A),小心打開夾子(I),使其緩慢注入反應瓶(H),同樣用1?2 mL蒸餾水沖洗漏斗后放入反應瓶(H),關上夾子(I),避免蒸餾過程氨散失。

         (4) 加熱蒸餾瓶(B)使反應瓶內液體開始沸騰,立即收集氨,當三角瓶中溶液由紫紅色變成鮮綠色開始記時,蒸餾5 min后移動三角瓶使液面離開冷凝管口約1 cm,繼續收集2~3min,zui后用蒸餾水把末端剩余的氨全部洗到三角瓶中,即算蒸餾完畢。排出廢液,量取5 ml蒸餾水蒸洗反應瓶一次,就可以進行第二份標準硫酸銨溶液的蒸餾工作。

         (5)將收集的各瓶蒸餾液分別用0.01 mol/L標準鹽酸溶液滴定至藍色消失,使溶液呈淡桔色為止。 

           用標準硫酸銨溶液連續測定3次,3次測定的終點顏色應一致, 滴定數據差值不超過±0.05ml.

         4. 樣品及空白的測定 

         將3.1操作所得的消化液在定氮儀上進行含氮量測定,方法與標準硫酸銨溶液測定相同,并進行空白測定。

        5.結果處理 

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