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        Folin-酚試劑法(Lowry法)測定蛋白質含量

        發布時間:2016-07-13 點擊次數:4030

        Folin-酚試劑法(Lowry法)測定蛋白質含量

         

        一、實驗原理

          蛋白質含有兩個以上的肽鍵(—CO—NH),因此有雙縮脲反應,在堿性溶液中,能與CU2+  形成絡合物。Folin-酚試劑反應是在雙縮脲反應的基礎上,引進Folin試劑(磷鉬酸-鎢酸試劑),蛋白質-銅絡合物能還原磷鉬酸-磷鎢酸試劑,生成藍色物質。在一定條件下,藍色強度與蛋白質的量成正比例。

           本法的優點是操作簡便、靈敏度高、較此外吸收法靈敏10~20倍,較雙縮脲法靈敏100倍,反應約在15min內有zui大顯色,并至少可穩定幾小時。其不足之處是此反應受多種因素干擾。對雙縮脲反應發生干擾的基團,Tris.HCL緩沖劑以及蔗糖、硫酸銨、巰基化合物,酚類及檸檬酸,均對此反應有干擾作用。在測試時應排隊干擾因素或做空白實驗消除。含硫酸銨的溶液只需加濃Na2CO3-NaOH溶液即可顯色測定。若樣品酸度較高,顯色后色淺,則必須將Na2CO3-NaOH溶液的濃度提高1~2倍。

           本法可測定范圍是25~250µg蛋白質。          

        二、實驗用品

        (一)器材

         (1)722型分光光度計。

             (2)恒溫水浴鍋。

             (3)試管及試管架。

             (4)0.5ml,1ml及5ml移液管

        • 試劑

           (1)試劑甲。

           (A)4%Na2CO3溶液;

           (B)0.2mol/LNaOH溶液;

           (C)2%酒石酸鉀鈉溶液(或酒石酸鉀、酒石酸鈉);

           (D)1% CuSO4.5H2O溶液;

             臨用前將(A):(B):(C):(D)=50:50:1:1(體積比)混合,此混合液即為試劑甲?;旌虾蟮娜芤?d內有效。

        (2) Folin-酚試劑(試劑乙):在1.5L容積的磨口回流瓶中加入100g鎢酸鈉(Na2WO4.2H2O),25g鉬酸鈉((Na2MoO4.2H2O),及700ml蒸餾水,50ml 85%磷酸,100ml濃鹽酸充分混合,燒瓶內加小玻璃珠數顆,以防溶液溢出,接上回流冷凝管以文火回流10h?;亓鹘Y束后,加入150g硫酸鋰(LiSO4),50m重蒸水及數滴液溴,開口繼續沸騰15min,以除去多余的溴。冷卻后溶液呈金黃色(如果仍呈綠色,須再重復滴加溴水的步驟),定容至1L,過濾,濾液置棕色瓶中保存,可在冰箱長期保存。若此貯存液使用過久,顏色由黃變綠,可加幾滴液溴,煮沸數分鐘,恢復原色仍可繼續使用。使用時用標準NaOH滴定酸度,以酚酞為指示劑。該試劑的酸度應為2mol/L左右,將之稀釋至相當于1mol/L酸度使用,即為Folin-酚試劑。

        (3)標準蛋白質溶液:可用結晶牛血清蛋白,預先經微量凱氏定氮法測定蛋白質含量,再根據其純度配制成500µg蛋白/ml溶液。

        (三)材料

             血清使用前稀釋100倍或約含20~250µg蛋白/ml溶液。

         

        三、實驗程序

            一、操作方法

         1.蛋白濃度標準曲線制作 

           取14支試管,分兩組按表9-1平行操作。

        繪制標準曲線:以OD650值為縱坐標,標準蛋白量為橫坐標,在坐標紙上繪制標準曲線。

         

        2.樣品溶液蛋白質濃度測定

          取6支試管,分兩組,按表9-2平行操作。

        3、計算

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